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第七章：實驗發現
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Author(s)
作者:
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Gert
van Zyl |
| Translator(s)
譯者: |
梁穎恩
LEUNG WING YAN
彭嘉豪PANG
KA HO |
Editor
(Chinese Version)
編者(中文版本): |
韋妙宜Mary
M.Y. Waye |
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English
version |
導論
自流感病毒在1933年第一次被描述時就發展出不同的診斷方法(Webster
1998)。這些診斷技術可以用作確認臨床診斷。這一章會討論最重要的診斷測試的角色和它們的優點及缺點。不過最好的診斷測試沒有適當的高質素樣本收集和正確的病人資料配合也是沒有甚麼幫助的。
人類流感的實驗室診斷
適當樣本收集
呼吸樣本
樣本收集的時間控制是十分重要，因為在病徵出現的四天內收集的呼吸樣本有最高的量(yield)。可以使用不同種類的呼吸樣本。鼻腔的洗涕液(nasal
washes)和鼻咽沖洗液(nasopharyngeal aspirates)的較咽喉拭子(pharyngeal
swabs)要敏感。要插喉的病人可以收集吸出的氣管分泌和支氣管灌洗液(WHO 2005a)。洗涕液及吸出的分泌液必需要有足夠的呼吸系統表皮細胞(respiratory
epithelium)作免疫體螢光測試法(immunofluorescence test)。沒有足夠細胞的樣本仍然可以用在其他方法上，如快速抗原檢測、病毒分離和逆轉錄酶聚合鏈反應(RT-PCR)。
棉花棒一定要用病毒運送液運送以避免乾燥。
所有的樣本一定要以盡快運到實驗室來避免分解。如果預計到在運送中途會有延誤，用病毒運送培養基運送時應該放在冰上或要冷藏在攝氏2-8度。
血液樣本
血液(全血，血清)樣本是收集作抗體血清學(確定對流感的抗體的存在)。應該收集相隔14至21天的急性和康復中血清樣本去證明對獨有品種的抗體度數(antibody
titre)顯著 (最少4倍)上升。
實驗室診斷的臨床角色及價值
病人管理
如果要考慮用昂貴抗病毒藥物作早期治療干預，快速診斷是很重要的
─ 那些藥物要有效就要在病徵出現後48小時內給服用(WHO 2005a)。適合作早期治療的是那些有些潛在因素和較高危會有嚴重併發症的病人
(請看第八章《臨床表現》)。流感的診斷，特別是老年病人使醫生知道第二期細菌如金黃葡萄球菌(Staphylococcus
aureus)，嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)和肺炎雙球菌或肺炎鏈球菌(Streptococcus
pneumoniae)感染的實際風險。
另外，快速流感病毒測試在醫院感染控制方面扮演重要角色，因為可以減少病人與病人之間的傳播和由受感染的醫療人員傳染給高危病人。這些測試還可以用在遊客或在半封閉空間如郵輪上的爆發作流感診斷(WHO
2005a)。
最後，流感診斷在健康的年青成人中有預後的價值，因為疾病進程通常是短期和良性的。
監察
流感警戒監察會用不同種類的測試，甚至在歐洲地區也好像欠缺一致性(Meerhoff
2004)。不同的技術有不同的好處和壞處，所以不同測試的組合會被用作監察。直接快速技術像逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR(Bigl
2002)或免疫酵素分析法(EIA)容許週期性爆發的快速發現，也可以用作分別甲型和乙型流感。分別病毒的亞型必須用已胚化的雞蛋或細胞培植的病毒分離法去辨別。血凝素
(haemagglutinin, HA)及神經胺酸酶 (neuraminidase, NA)亞型分別可以用血凝素抑制測定及逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR來確定。PCR產品的排序是用作建立流通病毒的分子流行病學。這和不同品種血凝素抑制度數一起容許WHO去建議最有可能對流通流感品種有保護的適當疫苗。監察對公共衛生政策也同樣重要，因為一次特別週期性疫症對健康的衝擊和干預如接種的成本效益比率會驅使制定政策的人對預防流感理出優先順序。
實驗測試
有很多因素要考慮才可決定取用甚麼測試。敏感度，獨特性，作業完成時間，重覆性，做測試的容易度和成本都要被考慮。逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR普遍較血清學和培植法敏感，而RT-PCR和血清學的組合比任何其他兩種測試的組合都要敏感(Zambon
2001)。培植的敏感度很大程度取決於做培植的實驗室。血清學比逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR便宜，不過血清學需要急性和康復中的血液樣本，診斷只是回溯性。傳統培植要花很多時間，不過平底小管技術使診斷可在48至72小時內完成。
直接方法
流感病毒的直接測試有不同方法。有些方法如免疫酵素分析法(EIAs)適合用作臨床測試，其他如直接免疫體螢光測試法(immunofluorescence)容許即場在診所準備載片，並寄已固定的載片到中央實驗室(Allwinn
2002)。逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR只可以在一所有足夠設備的實驗室由受過訓練的人員進行。這些方法可以測試到甲型和乙型流感兩種或分別出這兩種流感(甲型和乙型流感)。唯一直接而有能力去分別不同亞型的方法(即是按血凝素及神經胺酸酶的不同)是逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR。
免疫體螢光測試法(immunofluorescence)
直接免疫體螢光測試法，有可能已被感染的呼吸道上皮細胞被固定在載片上，細胞內的病毒抗原會被特定的抗體檢測：一是直接和螢光染料連結的抗體(直接免疫體螢光測試法)，二是由連結了螢光染料的抗抗體檢出抗體再檢出抗原。在兩個情況下反應都是用螢光顯微鏡影像化，而陽性的細胞和其他的分別在顏色的深淺和有螢光的地方的形態。直接免疫體螢光測試法會更快有結果，不過一般敏感度會比間接免疫體螢光測試低。間接免疫體螢光測試法同時的優點是集結在一起的抗血清可以用作篩選病毒感染，用連結了螢光染料的單一抗抗體(一般用二次螢光標記fluorescein
isothiocyanate-conjugated抗老鼠抗體；Stevens 1969)。免疫體螢光測試在有足夠呼吸道上皮細胞的樣本中可作出快速診斷。不過，不同人士在報告免疫體螢光測試法中存在差異，因為理解結果通常是主觀的而準確度是基於執行者的能力和經驗。
酵素免疫分析法(EIA)或免疫色層分析法(Immunochromatography
assays)
EIAs所用的是連結了酶的抗病毒抗原的抗體。培養的過程要加上發色的基質，之後的顏色轉變顯示病毒抗原的存在。不同的EIA和一些類似用免疫色層的分析法容許臨床測試(Allwinn
2002)在10-30分鐘內完成。這些快速分析法一般比直接免疫體螢光測試或病毒培植昂貴。EIAs的敏感度由64%至78%(Allwinn
2002)。不同的快速測試可以測試到甲型或乙型流感但不能分別出兩種流感，只能測出甲型流感病毒或可以測試到甲型和乙型流感和分別出是那種。但是沒有一種快速測試可以分別出感染人類的亞型(H1N1和H3N2)或不同的禽流感亞型(FDA,
2005)。一系列現有的快速測試可以從下列連結找到： http://www.cdc.gov/flu/professionals/labdiagnosis.htm
逆轉錄酶聚合鏈反應(RT-PCR)
逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR是一個首先由核糖核酸RNA轉化成互補去氧核糖核酸DNA(cDNA)的過程，接著基因組的一部份用特定能附上目標位置的引子(primer)增幅。這使很少的核酸可以透過熱穩定的DNA
聚合酶進行指數式增幅，容許高敏感度的測試檢出微量病毒基因組。
逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR不只有很高的敏感度(Steininger
2002)，而且逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR可以用作分別出不同亞型及進行演化分析(Allwinn
2002)。在已作檔案的樣本中RNA分解使逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR的敏感度下降(Frisbie
2004)。所以樣本一定要在收集後盡快處理。
分離方法
病毒分離或培植是一項將樣本接種在活培養基系統而發生病毒的感染是培養基系統測試成功的技術。因為培養基使病毒數目增大，所以這比直接的方法(除了逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR，因為逆轉錄酶聚合鏈反應RT-PCR也有增幅的成份)要敏感。只有當活系統或細胞對那想分離的病毒敏感，才可以使用病毒分離。
分離要求樣本快速運送到實驗室，因為任何延遲會導致病毒失去活性(Allwinn
2002)。
胚化蛋培養基
樣本會被接種到10-12天的胚化雞蛋的羊膜腔(amniotic
cavity)。孵育3天後可以收集到很高出產量的病毒(WHO 2005d)。
因為這個技術需要受精雞蛋和特別孵化機的供應，它已不再被用作流感感染的例行診斷。可是雞蛋分離法可提供大量的病毒及是一個敏感度高的培養系統，所以參考實驗室會用這個培養系統去確保高敏感度及可以用作製造病毒源作流行病學監察。
細胞培植
傳統的培植：用不同的細胞株去分離流感病毒，最常用的主要是猴子腎臟細胞和Madin-Darby氏狗腎臟上皮細胞(MDCK)。有些作者建議用胰蛋白酶(trypsin)幫助病毒進入這些細胞株(WHO
2005d)。傳統細胞培植要用兩星期的時間但敏感度很高。可以觀察到的細胞病變反應：包括有合胞體形成(syncytia)和細胞質內嗜鹼性包涵體的產生(intracytoplasmic
basophilic inclusion body)。流感病毒的存在可以用倉鼠紅血球(Weinberg
2005)作血細胞吸附(haemadsorption)或在培植細胞做免疫體螢光測試去確認。免疫體螢光測試也可以用作分離了的病毒的分類。免疫體螢光測試在陽性的培養基比血細胞吸附法有更高的敏感度。
平底小管培植：平底小管培植容許48小時內的診斷(Allwinn
2002)。在細胞培養基上的單層接種物的離心分離法及在細胞病變前進行免疫體螢光測試就可以作快速診斷。不過平底小管培植的敏感度比傳統培植低(Weinberg
2005)。
實驗動物
雪貂或白鼬通常都在研究設施中作人類感染流感的模型，但不會用作一般診斷。
血清學
血清學是指在血清(或其他體液)中測試到獨特對流感病毒的抗體。
血清學
血清學可探測抗體的總數或者種類(IgG、IgA和IgM)。
不同的血清學技術能用在流感診斷上︰血細胞凝集抑制(HI)、補體結合試驗(CF)、酵素免疫分析法(EIA)和非直接免疫體螢光測定法。
血清學診斷法在診斷急性流感沒有太大的價值。為了要診斷急性感染，需要起碼提升四倍的最小滴定量，當中必須包括急性和康復中的樣本。但是這診斷法於診斷近期的感染仍有價值。
血清學還用在測定流感疫苗的反應(Prince 2003)。
血清學在之前沒有感染流感的兒科病人有較大的臨床價值，因為曾受感染會導致有異組織的抗體反應(Steininger
2002)。
血細胞凝集抑制 (HI)
HI檢定是一種勞動密集和消耗時間的檢定，需要數個對照物來標準化，但是檢定的試劑卻很便宜和容易取得。使用不同的紅血球細胞好像供作實驗的豬、家禽和"O"型的人類紅血球細胞，普遍使用0.4
- 0.5%稀釋的紅血球細胞。血清是要預先處理以移除非特定的血細胞凝集素和抑制劑。病毒的血細胞凝集素預備產生可見的血細胞凝集(通常是4個血細胞凝集單位)，接著使用兩倍稀釋的血清樣本培養，最低稀釋度的血清能抑制血細胞凝集就是HI滴定量。HI比補體結合試驗靈敏(Julkunen
1985, Prince 2003)和擁有能明確地區別HA副型的好處(Julkunen
1985)。
補體結合試驗(CF)
補體結合試驗的原理在於抗原-抗體複合物可消耗補體的能力 -
- 這導致沒有足夠的補體去溶解山羊的紅血球。這個檢定是需要勞動密集的和在每一個步驟也需要對照物，但試劑卻很便宜和容易取得。CF檢定在診斷急性感染和接種疫苗之後的免疫測定都比HI的靈敏度為低(Prince
2003)。
酵素免疫分析法(EIA)
EIAs比起HI或CF檢定靈敏(Bishai 1978, Julkunen
1985)，有不同商品化的EIAs可以使用。探測IgG和IgA的檢定比IgM更為靈敏(Julkunen
1985)但不能作為急性感染的指標。
非直接免疫體螢光測定法
非直接免疫體螢光測定法是不常用作為探測流感病毒抗體的方法。
快速測試
診斷流感的臨床價值在於能大規模依靠一轉時間的特定測試。第一個給流感診斷的測試是由病毒隔離和血清學的檢定發展出來，當時需要超過兩星期去分出流感感染。雖然平底小管測試能減少隔離的一轉時間，但普遍仍不視為快速測試。
直接測試好像免疫體螢光測定法的發展令到診斷時間縮至數小時(1至2次的培養和洗滌)，但是需要有技術的實驗室人員和免疫體螢光顯微鏡的提供。
快速流感診斷的革命由快速抗原檢定(大部分根據EIA和免疫色層分析法的原理)的發展所引起的，這檢定令流感診斷時間縮至10-30分鐘。這些測試是很容易執行，即使是非受實驗室訓練的人員亦能在診所執行，這指是在床邊或照顧點的測試。
逆轉錄酶聚合鏈反應需要膠化電泳法起初很費時的，但較近期發展的即時技術使逆轉錄酶聚合鏈反應診斷有兩小時內完成的可能性。雖然抗原檢定普遍比較容易使用，但不比直接免疫體螢光測定法、隔離法和逆轉錄酶聚合鏈反應靈敏。
表1比較診斷流感的不同測試的特徵。
| 表1: 各特徵測試的比較* |
| 測試 |
靈敏度 |
一轉時間 |
執行的容易度 |
司負擔能力 |
| 直接探測 |
|
|
|
|
| 快速測試 (酵素免疫分析法/色層分析法) |
-2 |
+2 |
+2 |
0 |
| 免疫體螢光測定法 |
0 |
+1 |
+1 |
+1 |
| 膠化電泳逆轉錄酶聚合鏈反應 |
+2 |
0 |
-1 |
-2 |
| 即時逆轉錄酶聚合鏈反應 |
+2 |
+1 |
-1 |
-2 |
| 病毒養殖 |
|
|
|
|
| 一般病毒養殖 |
+2 |
-2 |
-1 |
+2 |
| 平底小管測試 |
+1 |
0 |
-1 |
+1 |
| 血清學 |
|
|
|
|
| 蛋白酶免疫反應檢定 |
+2 |
-2 |
+1 |
+1 |
| 血細胞凝集抑制 |
+1 |
-2 |
-1 |
+2 |
| 補體結合試驗 |
0 |
-2 |
-2 |
+2 |
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*名測試可取度的相對標準(五分順序尺度)
-2: 非常不可取的特徵
-1: 不可取的特徵
0: 平均特徵
+1: 可取的特徵
+2: 非常可取的特徵 |
禽鳥類疾病的不同診斷
很多不同的病徵被形容為流感類:：發燒、咳嗽、鼻塞、頭痛、心神不安和肌肉痛，但?似流咸?的病徵則是沒有清楚的介定和統一說法。
在流行病出現時，一些徵狀如發燒、咳嗽、嚴重鼻塞和食慾不振被高度評估為流感的先兆(Zambon
2001)，但是很多其他的感染亦有流感的病徵，這包括病毒、細菌、黴槳菌、類球菌目和真菌的感染，還有寄生蟲的感染。感染是可以危及生命的，即使對象是年輕人和健康人士，好像是病毒性出血發燒和對危機群好像是老人有生命威脅的退伍軍人症。起初的病徵和流感相似，所以這是很重要根據病人的病史考慮一個多邊性的診斷法，包括旅遊、職業的工作範圍、與動物和個別病人的接觸、病症史和本地的流行病學。
疑似人類感染禽流感病毒的診斷
簡介
實驗室準確和快速辨認疑似感染H5N1個案對開始和延續適當的治療和感染控制是最重要的。從疑似感染禽流感個案的樣本隔離病毒要在最少有三級生物安全的指定實驗室進行。
樣本收集
樣本的病毒探測和隔離應在病徵出現三日之內收集和快速傳送至實驗室。呼吸器和清理鼻腔、鼻咽及咽喉的棉花棒都是作為診斷的適合樣本，而呼吸器是樣本的首選。在病人要插喉的情況下，穿氣管呼吸器和支氣管肺胞灌洗液便可以收隻作樣本。
同一時間，急性和恢復期的血清樣本應收集作血清學診斷(WHO
2005b)。
病毒診斷型式
快速鑑定感染源如甲型流感可以由一般的快速測試來分別病毒的種類，但是市面上的快速色層分析法診斷禽流感的靈敏度只有用培養病毒的70%(Yuen
2005)。直接診斷H5N1感染可由直接免疫體螢光測定法用呼吸道細胞固定在玻璃片上加上使用綜合H5特異甲型流感單株抗體集匯庫，同時亦用H1和H3甲型特異及甲型/H1和甲型/H3特異流感單株抗體(由世衛提供)和用異硫氰酸盬螢光素(FITC)軛合的抗小白鼠抗體FITC在探測步驟中使用。這檢定容許快速從其他流感及其副型分別出人類H5流感感染，但不能分出是H5N1感染因為其靈敏度不高，所以應使用比較靈敏的培養和/或逆轉錄酶聚合鏈反應。
病毒可從已受精的雞蛋、Madin-Darby氏狗腎臟上皮細胞(MDKC)或恆河猴腎臟細胞(LLC-MK2)(de
Jong 2005, Yuen 2005)分離出，其他常見的細胞好像Hep-2或RD細胞也可感染H5甲型禽流感病毒。細胞病變效應是不特定的和甲型流感病毒感染細胞可由核蛋白用免疫體螢光測定法探測。HI中的細胞培養液表層、H5特定的免疫體螢光測(使用單細胞繁殖抗體去抵抗H5)或逆轉錄酶聚合鏈反應可用作細分這些病毒。引子已可提供給逆轉錄酶聚合鏈反應探測H5和N1禽流感的基因，H9特定的引子亦可提供。
使用即時逆轉錄酶聚合鏈反應探測H5甲型流感提供一個快速及高度靈敏的方法去診斷H5N1的感染(Ng
2005)。
血清學：由急性至恢復期的樣本提升四倍最小滴定量能診斷已康復的病人曾受感染。
其他實驗室發現
白血球減少尤其是淋巴球減少(在泰國已被證實是病人預後不良的跡象)，血小板減少和中度提升轉胺基酶水平也是普遍發現(Beigel
2005)。
新的發展及未來的流感診斷
少數的流感診斷趨勢已在觀察中，抗流感藥物應在感染早期時提供以使其有效，這需要已在早期診斷中強調並促使很多EIA或免疫色層分析快速測試的發展降低複雜性，所以能在臨床測試。然而這些測試值受其低靈敏度所限制尤其是禽流感的診斷。
即時逆轉錄酶聚合鏈反應容許一個高度靈敏及特有的替代。科技的進步令即時逆轉錄酶聚合鏈反應能廣泛地使用因儀器不斷地變得更小、更有效和更容易使用，所以即時逆轉錄酶聚合鏈反應以特別用在流感大規模爆發的準備上因為這令實驗室能快速靈敏和特定地診斷人類感染禽流感個案。唯一的障礙就是成本相對較高，但高度市場的競爭已將這測試變得較為可負擔得起的。
結論
份子診斷技術在實驗室診斷流感中扮演一個越來越重要的角色，直接快速測試亦變成診斷流感類似疾病的一個重要的工具。
但是病毒培養仍然重要尤其是在參考實驗室，因為它比較便宜、靈敏和容許對病毒有獨特性的鑒定，再者它不似分子測試，它是"沒有偏見的"和可以探測未被預計的新品種。
流感血清學的主要價值在於週年性爆發的流行病學調查、禽鳥對人的傳染和藥物與疫苗的試驗。它對一般的診斷沒有什麼價值。
我們可以總結流感的診斷對單體病人、流行病學調查和感染控制有價值。適當選擇特定的測試取決於該測試的特色和特定診斷的或公眾健康的需要。
診斷測試的陽性反應代表分辨似流感疾病和確切診斷為流感或分辨疑似人類感染禽流感個案和確診個案的不同。
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